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本發明公開了一種雙順反子表達載體、表達系統、制備方法及應用，屬于基因工程技術領域。該表達載體包含核基質結合區序列、內核糖體進入位點序列和篩選標記，通過在啟動子與IRES序列之間插入目的基因，可構成目的基因?IRES序列?篩選標記基因依次連接的雙順反子序列。表達載體的結構為：MAR?啟動子?目的基因?IRES序列?篩選標記?PolyA?MAR。該載體利用一個啟動子實現目的基因和篩選標記的同時表達，可減少由于不同表達框存在導致的假陽性細胞克隆，提高陽性細胞克隆篩選率，并克服傳統載體目的基因與篩選標記表達不均衡的問題；載體上包含MAR序列能克服轉基因沉默，實現轉基因在宿主細胞中的高效、長期表達。

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